Об'єктом Патологогістологіческое дослідження є зріз. Зрізи можуть бути виготовлені товщиною 1-2 мкм. Найбільш вживаними є зрізи товщиною 6-12 мкм.
Апарати, на яких виготовляються зрізи, називаються мікротомів (грец. «Мікрос» - малий і «темно» - ріжу).
Найбільш вживаними мікротомів є:
1. заморожувати мікротоми:
а) циліндричний, системи «Сарторіус»;
б) мікротом ТОС-1с термоелектричним охолоджуючим столиком.
2. Санний (салазочний) мікротом.
4. Ультрамікротоми різних марок.
Основних частин у кожного мікротома п'ять: 1) станина; 2) власник ножа; 3) предметний столик; 4) мікрометрична установка; 5) мікротомних ніж.
Станина являє собою масивну стійку основу апарату.
Тримач ножа забезпечується установкою, що дозволяє регулювати нахил ножа.
Предметний столик служить для фіксації об'єкта.
Мікрометрична установка служить для автоматичної подачі об'єкта до ножа з метою отримання зрізів необхідної товщини. Головною складовою частиною її є мікрометричний гвинт, тобто гвинт з дуже тонкої нарізкою.
Мікротомних ножі бувають трьох марок:
А) ніж із самої м'якої сталі, що вживається для різання парафінових блоків;
В) ніж з більш твердої сталі - для різання парафінових і целлоідінових блоків;
С) ніж із самої твердої сталі, вживається для отримання заморожених зрізів, має профіль рівнобедреного трикутника.
Марка стали позначається на обушком ножа.
Робота на заморожувати мікротому
На заморожувати мікротому виготовляються зрізи з об'єктів, що володіють достатньою компактністю.
Переваги замораживающей методики мікротомірованія:
1) відсутність необхідності в заливанні;
2) швидкість і простота виготовлення зрізів.
Недоліки замораживающей методики:
1) неможливість отримання серійних зрізів;
2) неможливість отримання тонких зрізів (мінімальна товщина 10 мкм);
3) дрібні і пухкі об'єкти різати не можна.
Виготовлення зрізів на заморожувати мікротому
1. Опустити предметний столик при ближньому положенні ручки мікротома.
2. Покласти шматочок матеріалу на столик.
3. Змочити шматочок водою.
4. Вкласти в гніздо ручки мікротома ніж марки «С».
5. Підняти столик до зіткнення шматочка з лезом ножа.
6. Встановити регулятор товщини зрізів.
7. Відкрити кран балона.
8. Заморозити шматочок до появи дзвінкого звуку при постукуванні по ньому.
9. Вирівняти поверхню шматочка.
10. Отримати зрізи і перенести їх в чашку з водою.
11. Після закінчення різання закрити кран балпона.
12. Вийняти ніж, осушити, покласти на місце зберігання.
13. Видалити шматочок з предметного столика.
14. Витерти насухо частини мікротома.
Робота на санному мікротому
Мікротом називається санним, так як частини його пересуваються в особливих пазах і ковзають на зразок саней.
Шляхом зміни предметних столиків відповідної конструкції санний мікротом може бути пристосований для різання будь-яких блоків і тому називається універсальним мікротомів.
Наклеєний на кубик блок виймають з 70% -ного етанолу і міцно зміцнюють в об'ектодержателе санного мікротома. Використовуються ножі типу «А» і «Б». Кут нахилу ножа гострий і регулюється в залежності від щільності блоку: чим м'якше об'єкт, тим гостріше кут нахилу. Ніж і об'єкт регулярно змочують 70% -ним етанолом (м'яким пензликом). При необхідності зрізи розправляють на лезі легким натисканням пензлика або подушечки пальця. Розправлені зрізи переносять в чашку Петрі, заповнену 70% -ним етанолом. У деяких випадках для хорошого расправления зрізи можна перенести з 70% -ного етанолу в дистильовану воду, де вони вирівнюються внаслідок різкої зміни поверхневого натягу.
Особливістю мікротома є нерухоме положення бритви і пересування об'єкта до бритви при кожному зрізі, що забезпечує отримання серійних зрізів.
Для різання парафінових блоків застосовують ножі марки «А» або «В». Блоки, наклеєні на кубики, закріплюють в об'ектодержателе. Підбирають кути різання і нахилу ножа. Ніж зміцнюють або перпендикулярно до длиннику мікротома, або косо. Підганяють блок до ножа так, щоб між ними була відстань 0,5-1 мм. Скальпелем зрізають надлишок парафіну, а мікротомних ножем - поверхневі шари матеріалу. Рухи мікротомних ножа повинні бути плавними і швидкими.
Якщо матеріал добре залитий, правильно підібрані кути різання і нахилу ножа лезо гостре, то зрізи розміщуються на поверхні ножа у вигляді стрічки.
При неправильної обрізки блоку зрізи мають незграбні контури, при наявності зазубрин ножа рвуться. Отримані зрізи з бритви знімають м'яким пензликом або препаровальной голкою (у цілому леза!) І переносять в теплу (40 ° С) кип'ячену воду, причому стороною, яка була звернена до ножа. У воді їх розправляють, потім знежирене скло з нанесеним клеєм (методику наклеювання див. Нижче) одним кінцем опускають в чашку з водою, до нього препаровальной голкою підводять зріз і поступово витягають з води. Можна взяти предметне скло, підвести під зріз під кутом 45 °, край зрізу притиснути до скла, а потім його разом зі зрізом вийняти з води. Предметні скла з розправленими на них зрізами осушивают гладкою фільтрувальної папером (рис. 9,10).
Заморожені і целлоідіновие зрізи піддають фарбуванню без попередньої обробки.
Парафінові зрізи наклеюють на предметне скло і депарафініруют.
Найбільш вживаним способом наклейки парафінових зрізів є так званий «японський» спосіб за допомогою яєчного білка.
Рецепт клею для наклейки зрізів
Яєчного білка - 2 ч.Гліцеріна - 1 ч.Камфори (тимолу) - 1 кристалик (протівогнілостное засіб).
1. Знежирення предметних стекол проводиться за допомогою обробки їх поверхні: спирт-ефіром або милом.
2. Наносять краплю клею, розтирають її пальцем на поверхні предметного скла до відчуття сухості.
3. Коагулюють білок на полум'ї пальника.
4. Виловлюють зріз з води на скло або сухий зріз кладуть на предметне скло і підливають під нього піпеткою кілька крапель теплої води. Завдяки цьому знищуються складки зрізу.
5. Підсушують зріз на склі при кімнатній температурі або в термостаті.
Наклеєні зрізи можуть зберігатися невизначений період часу.
Депарафінірованіем називається видалення парафіну з наклеєного зрізу.
Депарафінірованіе проводиться безпосередньо перед фарбуванням.
1. Скло зі зрізом опускається в розчинник парафіну (ксилол, толуол, бензол) до видалення парафіну облямівки навколо зрізу.
2. Видаляють розчинник парафіну зануренням скла зі зрізом в спирт-ректифікат або абсолютний спирт.
3. Обполіскують скло в воді.