Клонування ДНК - використання технології рекомбінантних ДНК для виділення і розмноження певної нуклеотидної послідовності, що міститься в складній суміші фрагментів ДНК. Для цієї мети спочатку всі фрагменти ДНК суміші впроваджують в клонуючий вектор. потім за допомогою скринінгу відбирають серед них рекомбінантні молекули, що містять цільової фрагмент ДНК, напр. ген. а потім здійснюють їх розмноження шляхом введення відібраної рекомбінантної ДНК в відповідну клітку-господаря, напр. в клітку кишкової палички.
Клонування ДНК включає 6 етапів:
1) отримання фрагментів ДНК, в тому числі генів або їх частин за допомогою ферментів рестрикції;
2) рекомбінація фрагментів,
3) вставка фрагмента ДНК в вектор;
4) трансформація за допомогою вектора організму хазяїна;
5) скринінг на рекомбінантний вектор
6) відбір цікавлять дослідника клонів.
Рестрикційні ферменти. Рестріктази. Ендонуклеази.
У кожній хромосомі людини є тільки одна безперервна нитка ДНК. Вона складно упакована для того, щоб поміститися в хромосомі. Маніпулювати з молекулою ДНК такої довжини практично неможливо.
Тому відкриття в 70-х роках XX ст. особливих бактеріальних ферментів. розрізають ДНК на окремі фрагменти, було дуже до речі. Ферменти були названі рестріктазамі або ендонуклеаза.
У бактерій ці ферменти служать для захисту від проникнення в клітину чужорідної ДНК. Зазвичай рестріктази розпізнають так звані паліндромний послідовності нуклеотидів, що спостерігаються в двох нитках ДНК і складаються з 4-6 нуклеотидів.
Генна інженерія
Методи клонування ДНК
Після того, як ДНК зшита в пробірці, її необхідно розмножити.
Існує два підходи до клонування ДНК. Перший підхід передбачає використання бактеріальних або дріжджових клітин для розмноження введеної в них чужорідної ДНК. Другий спосіб є амплификацию ДНК in vitro.
Клонування ДНК in vivo
Використовуючи мікроорганізми, можна створювати два типи бібліотек ДНК: геномної і клонову.
Геномна бібліотека. Якщо геном будь-якого організму розрізати, вставити в плазмідні або вірусні вектора і ввести в клітину, то в такому вигляді його можна зберегти. При розрізуванні плазмидной або фагової ДНК ймовірність випадання цілих і незмінених шматків генома досить висока.
Такий спосіб отримання геномної бібліотеки отримав назву «метод дробовика», так як геном в даному випадку представлений окремими фрагментами.
Принципи створення плазмідних та вірусних векторів загальні, тому розглянемо їх на прикладі плазмідних. Слід зазначити, що з вірусних ДНК краще використовувати ДНК фагів, так як вони мають велику ємність і дозволяють вставляти більші шматки генома.
Очищені кільцеві молекули ДНК обробляють рестриктазой, отримуючи лінійну ДНК. Клітинну ДНК обробляють тієї ж рестриктазой, додають до плазмидной, додають лігази. Таким чином отримують рекомбинантную плазмидную ДНК, яку вводять в бактеріальні або дріжджові клітини. Плазмида реплицируется з утворенням багатьох копій. Багато плазміди несуть ген стійкості до антибіотиків, і якщо в рекомбінантної плазміди є такий ген, то клітини легко виявляти, вирощуючи на середовищі з антибіотиком.
Кожна така колонія являє собою клон або потомство однієї клітини. Плазміди однієї колонії містять клон геномної ДНК, а сукупність плазмід можна назвати бібліотекою геномної ДНК. Недолік такого методу в тому, що фрагменти ДНК утворюються у величезній кількості. Розрізання геномної ДНК визначається випадком, тому лише частина фрагментів містять повноцінні гени. Деякі фрагменти можуть містити тільки частина гена або ж Інтрони послідовності.
Бібліотека кДНК. Створення кДНК починається з синтезу на матриці РНК за допомогою зворотної транскриптази комплементарної нитки ДНК. Потім створюють лужні умови, руйнують ланцюг РНК на нуклеотиди, після чого за допомогою ДНК-полімерази синтезують комплементарних ланцюг ДНК. При цьому утворюється фрагмент ДНК з тупими кінцями. Таку ДНК вбудовують в плазміди і вводять в клітини бактерій. При ампліфікації плазміди утворюється клон комплементарної копії ДНК.
Переваги клоновій ДНК перед клонами геномної ДНК в тому, що кодує білок нуклеотидних послідовність гена нічим не переривається.
Гени еукаріот містять інтрони, які повинні вилучатися з транскріптной РНК перед перетворенням її в матричну, після чого слід сплайсинг. Бактеріальні клітини не можуть здійснювати таку модифікацію РНК, що утворилася шляхом транскрипції гена еукаріотичної клітини. Тому якщо переслідують отримання білка шляхом експресії клонованого гена, то краще використовувати банк кДНК, отриманої на основі матричної РНК.
Рестрікція- лігування
У класичних методиках рестрикції і лігування, клонування фрагмента ДНК включає чотири стадії: розрізання ДНК ендонуклеаза рестрикції. лігування ДНК з вектором. трансфекція і подальший скринінг.
виділення вставки
Спочатку необхідно виділити ділянку ДНК для клонування. Часто препарат ДНК для клонування отримують за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. а також розрізняє ДНК рестріктазамі. обробкою ДНК ультразвуком. фракционированием за допомогою агарозного електрофорезу ДНК. Виділення вставки може бути зроблено технологією клонування шотган, комплементарної ДНК. штучним хімічним синтезом.
трансформація
Після лігування плазмидой трансформують бактерії для нарощування. Бактерії далі вирощують на селективної середовищі для відбору колоній, що містять встройку. Індивідуальні колонії відбирають і вивчають на наявність вмонтування.
трансфекція
Після лігування реакційну суміш зі вбудованим в необхідної орієнтації вектором поміщають в клітини. Залежно від типу клітин використовують хімічну сенситизацию клітин, Електропорація або генні гармати. Для хімічної сенситизації не потрібно спеціальне обладнання. Електропорація використовують в разі необхідності високої ефективності трансфекції. Генні гармати застосовують в разі рослинних клітин і тканин, так як клітинна стінка рослин не дає чужорідної ДНК проникати в цитоплазму і ядро.
Отримують культури трансфекованих клітин. Так як описані вище процедури часто мають низьку ефективність, потрібні способи виявлення клітин, що містять необхідну вставку в правильній орієнтації і відділення таких клітин від що не містять вставки. Сучасні вектори для клонування містять селективні маркери які дають можливість рости тільки клітинам з правильною вставкою рости на селективної середовищі. Вектори для клонування також часто містять маркери, що зумовлюють забарвлення колоній, наприклад при вирощуванні на середовищі, що містить X-gal. Для точного підтвердження успішного клонування, потрібна перевірка за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів або секвенування ДНК.
генна терапія
клонування ДНК
Клонування ДНК - процес виділення заданої послідовності ДНК і отримання багатьох її копій in vitro. Клонування ДНК часто застосовують для ампліфікації фрагментів, що містять гени. а також будь-які інші послідовності-наприклад, промотори. некодуючі послідовності. хімічно синтезовані олігонуклеотиди і випадкові ділянки ДНК.
Джерела: humbio.ru, dommedika.com, www.biotechnolog.ru, dic.academic.ru, ru.rfwiki.org