Метод вагінальних мазків. Цей метод можна застосовувати тільки для визначення жеребости кобил. Перед взяттям слизу з піхви необхідно зовнішні органи кобили обмити теплою водою з милом. Потім, запровадивши зеркало-розширювач у піхву, беруть слиз від щирого верхнього зводу піхви у вигляді довгою гострої ложечки з якими попередньо затупленими краями або стерильним ватним тампоном. Після отримання слизу роблять мазок на предметному склі з слизу. Для виробництва мазка можна скористатися покривним склом. Мазок висушують, фіксують метиловим спиртом протягом 5 хвилин, забарвлюють по Гімза (2 краплі на 1 мл дистильованої води) протягом 25-30 хвилин і ретельно просушують.
При мікроскопічному дослідженні мазка слизу від жеребой кобили виявляються клітини миготливого епітелію, слизові кулі і рідко - лейкоцити. У нежеребого кобил під вагінального слизу спостерігають нейтрофільні лейкоцити, клітини плоского епітелію і один які клітини миготливого епітелію.
В якості додаткових свідчень для постановки діагнозу на жеребость звертають увагу на клінічні ознаки, спостережувані при макроскопічному дослідженні порожнини піхви.
Слизова оболонка піхви з 3-тижневої жеребости тваринного покривається густий, дуже в'язкому і каламутній слизом, яка утрудняє введення і виведення вагінального дзеркала. З цього терміну жеребости слизова оболонка піхви стає анемічного, сухий і без блиску. Отвір шийки матки щільно закрито слизом, котра утворює хіба що пробку, як наслідок вагінальна частина шийки матки виглядає тьмяною. До 4-5 тижнів жеребости вагінальна частина шийки матки відхиляється зазвичай вправо чи вліво.
Гормональний метод. На підставі вивчення фізіології передньої долі гіпофіза і яєчника розроблена реакція на вагітність, заснована на дуже ранню появу в крові лошат кобил гормону пролана і в сечі вагітних кобил, корів і свиней - гормону фолликулина.
Для дослідження на пролан у тварини беруть з яремної вени близько 25 # 9235; 50 мл крові, з її відстоюють сироватку, яку ін'єктують без будь-якої обробки під шкіру мишам. Ін'єкція в кількості по 0,1-0,4 мл досліджуваної рідини здійснюється протягом 3 днів по 2 рази в день інфантильним (статевонезрілі) мишам-самкам. Вага такої миші становить 6-8 г (3-4 роки).
Для дослідження на фолликулин у тварини беруть сечу у вигляді катетера або шляхом вичікування природного сечовиділення. Сеча перед ін'єкцією мишам піддається обробці ефіром зниження її токсичності. Для цього сеча відстоюється. Виниклий згори прозорий шар зливається в кількості до 10 мл. подливается оцтової кислоти для створення слабокислою реакції і додається ефір в рівному обсязі. Після цього сеча струшується протягом 5 хвилин. Потім вмісту пробірки дають відстоятися протягом 10 хвилин; ефір зливають, а сечу залишають у відкритому посуді на кілька годин для повного видалення залишків ефіру. Тоді сечу розбавляють в 3 рази дистильованою водою і в такому вигляді впорскують під шкіру мишам в шість прийомів протягом 3 днів. Для виявлення фолликулина сеча вводиться кастрованим мишам-самкам або інфантильним.
Для уточнення діагнозу сеча або кров від кожного досліджуваного на вагітність тваринного вводиться 3-4 мишам. При наявності в досліджуваній рідині статевих гормонів тічка у мишей з'являється через 72-100 годин після початку ін'єкції. Для виявлення тічки, починаючи з ранку 3-го дня, від мишей за допомогою тампона беруть двічі на день виділення з піхви. З отриманої слизу роблять на матеріальному склі в краплі води мазок, який розглядають під мікроскопом.
При наявності тічки у мишей в мазку виявляються лише суцільні маси клітин ороговевшего без'ядерного епітелію. У період спокою в мазку виявляються лейкоцити і ядерні епітеліальні клітини.
Реакцію тічки підтверджує розтином піддослідних мишей, при якому виявляють збільшення і гіперемію матки. При реакції на пролан необхідно для додаткової перевірки розкрити жодну з піддослідних мишей і в разі позитивного результату знаходять збільшення яєчників, присутність в них зрілих фолікулів, червоних кров'яних точок на місці виявило граафових бульбашок і навіть жовтих тіл. Крім того, добре помітні гіпертрофія і гіперемія статевих органів.
Мінімальна кількість гипофизарного або фолікулярного гормону, здатне викликати реакцію тічки у самок-мишей, називають мишачої одиницею.
З 3 місяців жеребости і по пологів визначення жеребости виробляють на підставі обнаруживания в сечі жеребой кобили величезної кількості гормону фолликулина, що обчислюється в десятках і навіть сотнях тисячах мишачих одиниць на літрі сечі. Правда, гормон фолликулин виявляється і нежеребого і на початку жеребости кобил, проте його обчислюється лише в декількох тисячах мишачих одиниць на літрі сечі. Таким чином, за різницею в кількості гормону фолликулина можна судити про жеребости кобили.
Мікроскопія мазків з піхвового слизу. Слиз беруть із шийки матки (краще з її гирла) стерильним щільним ватяним тампоном з допомогою корнцанга. Ці тампоном роблять рівні мазки на сухому, знежиреному предметному склі. Мазки висушують на повітрі, фіксують метиловим спиртом протягом 5 хвилин, забарвлюють фарбою Гімза (на 1 мл дистильованої води 2-г краплі фарби) протягом 25-30 хвилин, ретельно змивають фарбу, висушують і проводять мікроскопію.
В мазках з слизу, взятої у лошат кобил, знаходять значну кількість клітин миготливого епітелію, слизові кулі блакитного кольору, поодинокі клітини плоского епітелію і іноді незначна кількість лейкоцитів.
В мазках з слизу, взятої у нежеребого кобил, виявляють велику кількість лейкоцитів і клітин плоского епітелію, поодинокі клітини миготливого епітелію. Шаров з слизу немає. Слиз на мазку лежить рівним шаром.
Біологічне дослідження крові і сечі. У період вагітності в крові і сечі кобил накопичується досить велика кількість гонадотропних (фолікулостимулюючий гормон - ФСГ і лютеїнізуючого гормону - ЛГ) і гонадального (фолликулин) гормонів, стимулюючих функціональну діяльність статевих органів.
Діагностика жеребости за результатами біологічного дослідження крові або сечі заснована на виявленні кількісного в них названих гормонів. Цей метод діагностики відрізняється високою точністю (95-100%), але, незважаючи на це, при масових дослідженнях на жеребость його рідко через складність і дорожнечу його виконання.
Для виявлення гормонів в крові і сечі лошат кобил існують такі способи: 1) Колла і Харта, 2) Фрідмана і Шнейдера, 3) Цондека і Ашгейма.
Для цієї ж мети запропонована пересадка яєчника в передню камеру очі кастрованих кролиць. При вдалій операції, з ослабленням запальної реакції, рогівка прояснюється (в перші дні післяопераційного періоду вона каламутніє), і за привившимся яичником дуже просто і зручно вести спостереження.
Після введення досліджуваної сироватки в вушну вену кролиць в трансплантаті можна бачити крововиливи, через три дні - збільшення фолікулів, а через п'ять днів - ясну лютеинизацию.
Реакція Цондека і Ашгейма. Суть реакції - виявлення фолликулина в сечі мул крові вагітних.
Ці дані вказують на доцільність застосування фолликулиновой реакції переважно після третього місяця жеребости, а в більш ранній стадії - дослідження на пролан.
Техніка реакції. Сечу пропускають через паперовий фільтр, подкисляют оцтовою кислотою до слабокислою реакції (лакмус). Для звільнення від токсичних речовин до сечі додають однакову кількість ефіру і ретельно збовтують. Ефір зливають, а сечу залишають стояти відкритої до випаровування залишків ефіру (поки не залишиться слабкий запах). Обробка ефіром підвищує активність фолликулина.
Лабораторними тваринами служать оваріоектомірованние білі миші (кастрати), витримані протягом двох тижнів після операції і перевірені на відсутність тічки. Можна використовувати інфантильних самок мишей; у кожної з них забарвити шерсть на умовному місці і протягом трьох днів двічі на день вводити під шкіру:
до а з т р а т а м
1-й миші - 0,3 цільною мочи
4-й »- 0,1 сечі, розведеною
1-й миші - 0,2 цільною мочи
4-й »- 0,1 сечі, розведеною
Якщо є підстави припускати пізніший термін жеребости, коли фолликулина в сечі багато, можна всім мишам вводити сечу, розведену водою в 2-3 рази.
Через 100 годин після першої ін'єкції (краще з 70-80-ї години) з вагінального слизу кожної миші тричі на день виготовляють мазки. Для отримання матеріалу і приготування мазків вживають платинові петельки. Прокаленную на спиртівці петельку занурюють в дистильовану воду і разом з захопленої нею краплею води вводять в піхву. Для вилучення слизу петлі проводять по слизовій оболонці легким скоблящим рухом. Тієї ж петлею слиз розмазують на поверхні предметного скла. На одне скло можна нанести 3-ж мазків. Кожен мазок позначають восковим олівцем тим номером, яким позначена миша.
Мазок висушують на повітрі, фіксують спиртом і забарвлюють за Романовським або переглядають під мікроскопом без забарвлення, в затемненому полі зору. Наявність в мазку без'ядерних клітин (лусочок), вказують на появу тічки, розцінюється як позитивний діагноз. У сумнівних випадках можна розкрити 1-2 миші. Діагноз підтверджується виявленням матки, збільшеною під впливом фолликулина.
Практично виявлення пролана в сироватці крові кобил може бути здійснено в період між 40-120 днями жеребости (з половини другого до п'ятого місяця).
Тестоб'ектов служать інфантильні миші (вагою 6-8 г) або щури (вагою 20-28 г).
З вени кобили, підлягає дослідженню, беруть близько 50 мл крові і ставлять в прохолодне місце для відділення сироватки. Останню вводять під шкіру трьом мишам чи пацюкам в дозах (мл):
Всього роблять шість ін'єкцій протягом трьох діб (по дві ін'єкції на добу).
На 4-5-й день після початку ін'єкцій від піддослідних тварин 2-3 рази в день готують мазки з вагінального слизу і досліджують під мікроскопом. Якщо кобила була жеребой, то під впливом наявного в крові пролана у інфантильних мишей чи пацюків відбувається статеве дозрівання - розвиток фолікулів. З дозріванням фолікулів утворюється в них фолликулин викликає течку, і мазок складається з без'ядерних клітин (лусочок). Якщо картина не ясна, через 100 годин після початку ін'єкції мишей вбивають. При наявності у кобили жеребости у мишей вдасться встановити збільшення рогів матки, а в яєчниках - зрілі фолікули, жовті тіла або фолікули, заповнені кров'ю.
Вирішальне значення мають зміни яєчників і матки, тому для судження про реакцію всіх або деяких мишей вбивають або розкривають.
Реакція Фрідмана і Шнейдера. Об'єктом служать кролиці вагою 900-1200 г, тобто досягли статевої зрілості. Самки повинні міститися ізольовано від самців, а ще краще і від самок.
Десять мілілітрів сироватки крові досліджуваної кобили вводять у вушну вену кролиці. Через 36-48 годин після ін'єкції у кролиці виробляють лапаротомію і огляд яєчників. Після ін'єкції сироватки на місці розірвалися фолікулів або виявляють фолікули, порожнину яких заповнена кров'ю (рис. 36).
Мал. 36 Яєчники кролиці: зліва - при позитивній реакції на вагітність, праворуч - при негативній (по Н. А. Флегматову).
Після огляду яєчників рану черевної стінки зашивають. Через 2-3 тижні цю ж кролицю можна використовувати вдруге (іноді одне тварина вдається використовувати 5-6 разів). При повторних ін'єкціях слід мати на увазі можливість анафілаксії.
До переваг цієї реакції належать вкорочення терміну її до 48 годин, замість 100 годин при методиці Колла і Харта.