Основи молекулярної біології
I. Білок - субстрат життя
Основу життєдіяльності живих організмів становлять процеси перетворення речовин (окислення, відновлення, розщеплення, синтез). Протягом життя кожна клітина засвоює і продукує різні речовини, будує і оновлює свої структури, виконує певні функції. Основним будівельним матеріалом в клітці є білок (матриксу цитоплазми, ядра, мітохондрій, пластид; мембранні і немембранні органели) - це структурні білки.
Особливу групу структурних білків складають скоротливі білки, які формують опорно-рухові елементи клітини (мікротрубочки, мікрофіламенти, мікрофібрили) і визначають рух клітин, поділ, фагоцитоз і ін. До таких білків належать: актин, тубулін, міозин і ін. Перетворення речовин в клітині здійснюється за допомогою ферментів, хімічної основою яких є білки. Таким чином, структурна (пластична) і каталітична (ферментативна) функції є головними функціями білка в будь-якій клітині, саме білки визначають і будова клітини і процеси її життєдіяльності. Крім цього, білки виконують численні функції в клітині і організмі (табл. 2).
Білки є універсальними молекулами і мають принципово схожу будову у тварин, рослин, бактерій і вірусів. Кожен білок в своїй первинній структурі є ланцюжком амінокислот, сполучених пептидними зв'язками (поліпептид). Але в той же час, організми різних видів розрізняються своїми білками; різні тканини одного і того ж організму побудовані з різних білків (сполучна тканина - колаген; м'язова тканина - актин, міозин, міоглобін; нігті, волосся - кератин і т.д.); єіндивідуальні відмінності організмів за будовою білків - отже, білки володіють специфічністю. Специфічність білків обумовлена особливістю первинної структури. Поліпептидні ланцюги розрізняються між собою набором амінокислот, послідовністю їх розташування і кількістю. Різноманітність білків величезна.
II. нуклеїнові кислоти
У багатоклітинних організмі клітини диференціюються і тому, клітини однієї тканини подібні, а клітини різних тканин розрізняються по морфології і функцій. При розподілі кожна клітина утворює собі подібні дочірні клітини (з клітин печінки утворюються клітини печінки; з клітин шкіри - клітини шкіри). Щоб синтезувати білки, характерні для даного типу клітин, щоб відтворювати собі подібних - необхідно мати інформацію, укладену в якомусь матеріальному субстраті, яку: а) можна використовувати в процесі життєдіяльності і б) передавати дочірнім клітинам при розподілі. Це забезпечує спадкоємність в будові і функції клітин і організмів в поколіннях. Матеріальним субстратом - носієм генетичної інформації є ДНК (у деяких вірусів - РНК). Реалізація генетичної інформації відбувається за участю різних РНК (мРНК, тРНК, рРНК). Нуклеїнові кислоти - біополімери, що складаються з мономерів-нуклеотидів. Будь-нуклеотид складається з трьох частин: вуглеводу, залишку фосфорної кислоти і азотистої основи. Кожна молекула нуклеїнової кислоти - це певні послідовності нуклеотидів. При з'єднанні нуклеотидів в ланцюг утворюються зв'язки між углеводом і залишком фосфорної кислоти. Вуглецевий атом в 5 положенні рибози (дезоксирибози) одного нуклеотиду з'єднується через фосфатну групу з вуглецевим атомом в 3 положенні цукру попереднього нуклеотиду.
Таким чином, перший нуклеотид в ланцюзі має вільний вуглецевий атом в 5 положенні, а останній - в 3 положенні (рис. 9), тому кінці
полінуклеотидних ланцюгів позначаються як 5 / і 3 /. У молекулі ДНК дві полінуклеотидні ланцюга, вони антіпараллельни, тобто там, де у одного ланцюга 5 / кінець - у другій - 3 / кінець і навпаки.
Принципово будова ДНК і РНК схоже, але є і відмінності: молекула ДНК складається з двох полінуклеотидних ланцюгів (РНК - один ланцюг), до складу ДНК входить вуглевод дезоксирибоза (РНК - рибоза), до складу ДНК входять азотисті основи - аденін, тимін, гуанін , цитозин (в РНК замість тиміну входить урацил). Нуклеотиди одного ланцюга ДНК (РНК) розрізняються між собою тільки азотистих основ. Дві ланцюга нуклеотидів ДНК з'єднуються водневими зв'язками за правилом комплементарності: А-Т; Г-Ц.
ДНК міститься в ядрі клітини, РНК - в ядрі (в основному, в полісом) і цитоплазмі (гіалоплазма, рибосоми). Крім того, деякі органели мають власну ДНК і всі види РНК (мітохондрії, пластиди).
ДНК була відкрита в 1869 році (Мишер), але тільки в 1953 році було розшифровано будова цієї молекули (Уотсон і Крик).
Основна біологічна роль ДНК складається в зберіганні, передачі і самовідтворення спадкової (генетичної) інформації.
Будова ДНК універсально (принципово однаково у всіх живих організмів), але різні молекули ДНК розрізняються між собою.
Специфічність ДНК залежить від нуклеотидного складу, послідовності нуклеотидів, кількості нуклеотидів. Таким чином, від того які нуклеотиди входять до складу молекули, як вони розташовані і скільки їх, залежить обсяг інформації і її сенс.
У будові ДНК міститься інформація про структуру білків організму і рибонуклеїнових кислот (тРНК, рРНК).
Спадковий апарат організований по-різному у вірусів, прокаріотів і еукаріотів. У вірусів - це може бути молекула ДНК або РНК (різної структурної організації).
У прокаріотів генетичний апарат представлений двухцепочечной кільцевою молекулою ДНК (нуклеоїд, генофором), в якій міститься основна видова спадкова інформація, і плазмонів - сукупністю автономних генетичних елементів. Це дрібні кільцеві молекули ДНК - плазміди і епісоми, що містять обмежену інформацію про деякі ознаки даного організму (в плазмидах R знаходяться гени стійкості до антибіотиків; епісоми F визначають здатність до розмноження). Плазміди і епісоми здатні до реплікації і переміщенню з клітки в клітку при кон'югації.
У еукаріот генетичний апарат представлений надмолекулярними структурами - хромосомами, хімічної основою яких є хроматин (ДНК + білки). Хроматин може бути конденсованих, неактивний - гетерохроматин, або деконденсірован, активний - еухроматин (див. Стор. 24). Не вся ДНК еукаріот є інформативною. Велика частина її представлена регуляторними послідовностями. Багато ділянок повторюються в геномі (помірні і високі повтори).
Основні відмінності в організації генетичного матеріалу у про- і еукаріот зведені в таблицю 3.
III. Генетичний код, його характеристика
Сенс генетичної інформації зашифрований в молекулі ДНК. Генетичний код - це система запису генетичної інформації, яка використовується кліткою в процесі життєдіяльності. Іншими словами - це система розташування нуклеотидів в молекулі ДНК,
що визначає послідовність амінокислот в молекулі білка (правило коллинеарности). Одиницею генетичного коду є триплет нуклеотидів в молекулі ДНК (кодон), який соответств ует одній амінокислоті.
Генетичний код характеризується:
а) універсальністю (іншого способу запису генетичної інформації в природі немає)
б) тріплетном (одиниця генетичного коду - триплет нуклеотидів - кодон)
в) надмірністю (виродження)
г) однозначністю
д) наявністю смислових, терминирующего та ініціюючих кодонів.
IV. Реалізація генетичної інформації в клітині
Реалізація генетичної інформації відбувається протягом усього життя клітини в процесі біосинтезу білків, характерних для даного виду організмів (клітин).
Інтенсивність біосинтезу білка найбільша в інтерфазі, знижується до початку поділу, майже нульова при розподілі і зростає відразу після ділення. Біосинтез білка можна розділити на два етапи: транскрипція (відбувається в ядрі на ДНК) і трансляція (відбувається в цитоплазмі на рибосомах).
Функціональною одиницею, яка бере участь в транскрипції, є цистрон - відрізок ДНК складається з трьох частин:
а) промотор (близько 40 пар послідовностей), з яким зв'язується фермент РНК-полімераза;
б) послідовності, відповідні структурному гену;
в) термінальний ділянку (трейлер), де закінчується транскрипція.
Біологічної сутністю транскрипції є "переписування" генетичної інформації з молекули ДНК на РНК, а хімічної - синтез молекули мРНК. Біологічної сутністю трансляції є переклад інформації з мови нуклеотидів на мову амінокислот (розшифровка генетичного коду), а хімічної - синтез поліпептидного ланцюжка.
Обидва процеси відносяться до реакцій матричного синтезу, які характеризуються: наявністю молекули-зразка (матриці), енергії, специфічного ферменту, виконанням правила комплементарності і протікають в три етапи (ініціація, елонгація, термінація). У прокаріотів синтезована мРНК відразу може служити матрицею для трансляції.
У еукаріот інформативні послідовності структурного гена (екзонів) розділені неінформативними (інтрони). Первинний транскрипт включає як Екзони, так і інтрони - це незріла або про-мРНК. Потім починається процесинг (дозрівання мРНК), в результаті якого видаляються інтрони і утворюється зріла мРНК, що складається тільки з екзонів. Процесинг складається з двох етапів: сплайсингу і модифікації (рис. 10).
Трансляція (рис.10)
також складається з ініціації, елонгації та термінації.
Місцем трансляції є рибосоми. В рибосомах є два активних функціональних центру - пептідільний і аміноацільний. Чи не працює рибосома диссоциирована на дві субодиниці: малу і велику.
Ініціація трансляції починається зі зв'язування мРНК з малою субодиницею рибосоми, причому необхідно щоб в її пептідільний центрі виявився триплет АУГ - це ініціює кодон. З цим кодоном зв'язується тРНК-f-метіонін, а потім мала і велика субодиниці рибосоми об'єднуються. Рибосома готова до роботи. У аміноацільном центрі рибосоми знаходиться інший триплет нуклеотидів мРНК, з яким може зв'язатися тРНК, що має комплементарний антикодон. Коли це станеться, то між двома амінокислотами (одна - f-метіонін в пептідільний центрі, друга - в аміноацільном центрі) виникає пептидний зв'язок - утворюється дипептид, ініціація завершилася. Рибосома пересувається по мРНК на один триплет, який виявляється в аміноацільном центрі, тРНК з нього переміщається в пептідільний центр; вона пов'язана з дипептидом, а перша тРНК йде в цитоплазму. Аміноацільний центр вільний, в ньому знаходиться новий кодон, з яким може зв'язатися тРНК з комплементарним антикодоном. Так, пересуваючись по мРНК, рибосома "прочитує" інформацію, переводить її на мову амінокислот і поліпептидний ланцюг нарощується. Це - елонгація. Елонгація відбувається до тих пір, поки на шляху рибосоми в А-центрі не виявиться кодон-термінатор. Тоді поліпептидний ланцюг від'єднується від рибосоми, мРНК теж відокремлюється від рибосоми, рибосома дисоціюють на субодиниці, відбувається термінація Етапи трансляції (рис.10):
Ініціація 1-5. Початок матричного синтезу (трансляції) відбувається поетапно:
1 зв'язування мРНК з малої (30 S) субодиницею рибосоми
2 - установка в пептідільний центрі (Р) ініціюючого кодону АУГ (AUG)
3 - зв'язування тРНК з амінокислотою форміл-метіонін (тРНК - f-met) з кодоном АУГ (освіта ініціюючого комплексу)
4 - приєднання великий (50 S) субодиниці рибосоми
5.1-освіту комплексу кодон-антикодон в аміноацільном (А) центрі
5.2 - освіту пептидного зв'язку між форміл-метіонін і другий амінокислотою (освіта дипептида)
5.3 - транспозиція рибосоми (переміщення) по мРНК на один триплет (при цьому перша тРНК залишає рибосому, друга тРНК, з якою пов'язаний дипептид, переміщається з А - в Р центр, а в А центрі з'являється новий кодон).
Елонгація 6 - 9. Поглиблення і прискорення процесу трансляції, результатом чого є нарощування поліпептидного ланцюга. Складається з багаторазово повторюваних етапів:
6 - транспортування амінокислот в рибосому за допомогою тРНК
7.1-освіту комплексу кодон-антикодон в А центрі
7.2 - освіту пептидного зв'язку між амінокислотами
8 - транспозиція рибосоми по мРНК на один триплет
Терминация 10-11. Закінчення трансляції.
10 - поява в А центрі після чергової транспозиції рибосоми терминирующего кодону (УАА, УАГ, УГА)
11.1-в Р- центрі дестабілізується і втрачається зв'язок між тРНК і мРНК
11.2 - поліпептид отщепляется від тРНК
11.3 - мРНК залишає рибосому
11.4 - дисоціація рибосоми на субодиниці
Починається процес з розриву водневих зв'язків між азотистими основами ДНК на ділянці, що включає близько 300 пар нуклеотидів - це місце називається точка ініціації. Так як роз'єднання ланцюгів ДНК від точки ініціації йде вправо і вліво одночасно, ланцюги ДНК антіпараллельни, а фермент ДНК-полімераза може працювати тільки в одному напрямку (поєднуючи нуклеотиди від 5 вуглецю подальшого до 3 вуглецю попереднього), то синтез дочірніх ланцюгів йде по-різному на різних ділянках одного реплікону. Одна ланцюг - лідируюча, синтезується безперервно, а друга - відстає, синтезується фрагментарно (Рис. 11б).
На ланцюга 3 / _5 / поруч з точкою ініціації є особлива послідовність нуклеотидів - сайт ініціації, на якому синтезується невелика молекула РНК (РНК-запал). У РНК-затравки вільний 3 / - кінець, до якого приєднується перший нуклеотид ДНК, до нього другий і т. Д. В результаті синтезується лідируюча дочірня ланцюг. На протилежній, антипараллельной ланцюга (5 / -3 /) сайту ініціації немає і проходить час, поки в
Внаслідок розриву водневих зв'язків виявиться такою сайт; РНК-запал синтезується і від неї в сторону протилежну напрямку роз'єднання ДНК синтезується невеликий фрагмент дочірньої ланцюга. Після роз'єднання наступної ділянки молекули ДНК, наступна молекула РНК-запал знаходить свій сайт і синтезується новий фрагмент дочірньої ланцюга ДНК в напрямку 5 / -3 / і т.д. Таким чином, цей ланцюг синтезується невеликими фрагментами (фрагменти Окадзакі) і відстає в часі. На іншій половині реплікону, де роз'єднання ланцюгів ДНК йде в інший бік, також, в одному напрямку дочірня ланцюг синтезується безперервно, в іншому - фрагментарно. Потім рестріктази вирізують РНК-затравки (одну - з лідируючої ланцюга і від кожного фрагмента Окадзакі на відстає ланцюга), ДНК-полімераза добудовує молекулу ДНК на місцях вирізаних РНК-запалів, а лігази з'єднують фрагменти в безперервний ланцюг. У кожній новій молекулі ДНК один ланцюг стара (материнська), а друга - нова (дочірня). Такий спосіб реплікації називається напівконсервативним.
VI. Зворотній транскрипція
Подання про направлення потоку інформації в клітині і послідовно-вательності процесів отримало назву центральної догми молекулярної біології. Передача генетичної інформації йде в напрямку
Однак, виявилося, що іноді інформація може передаватися від РНК до ДНК. Це явище було вивчено у вірусів, генетичний апарат яких представлений не ДНК, а РНК. Це група ретровірусів, до яких відноситься вірус грипу, СНІДу та ін. Щоб після впровадження таких вірусів в клітину господаря їх генетична інформація могла бути використана для синтезу вірусних білків, необхідно на вірусної РНК синтезувати ДНК, з подальшим встраиванием її в геном клітини. Цей процес йде під контролем ферменту ревертази (зворотної транскриптази) і називається зворотною транскрипцією. Таким чином, напрямок потоку генетичної інформації в клітині в остаточному вигляді виглядає так:
Відкриття явища зворотної транскрипції зіграло велику роль у розвитку генної інженерії, мікробіології. За допомогою ревертаза отримують важливі лікарські препарати білкової природи (інтерферон, гамма- глобулін та ін.), Вводячи в мікробну клітину мРНК людини з інформацією про будову цих білків.