Найбільш швидким, простим, не вимагає застосування спеціальної апаратури методом заливки матеріалу є спосіб, розроблений І. І. Золотих в патологоанатомічному відділенні Інституту хірургії ім. А. В. Вишневського.
96% спирті 15 хв
100% Спирт 15 хв
Хлороформ 15 хв
Хлороформ-парафін при 56 ° С 15 хв
Парафін при 56 ° С, енергійно струшуючи 1 хв
Парафін при 56 ° С 45 хв
Тривалість 2 год 30 хв
У нас заливка проходить наступним чином:
Формалін 10% 24 години
Промивання проточною водою 1 годину
спирт 70% (зневоднення) понад 4 години
спирт 80% понад 4 години
спирт 96% понад 4 години
спирт + хлороформ 1: 1 до 1 години (пересушується)
хлороформ чистий до 1 години
хлороформ чистий до 1 години
хлороформ + парафін 1: 1 37С до 1 години
парафін 1 56С 45 м
парафін 2 56С 45 м
Для приготування препаратів слід:
ксилол 1 (депарафінізації) 56С 10 м
ксилол 2 56С 10 м
гематоксилин 5 м
промиваємо дистильованою водою
ксилол 56С більше 10 м (для просвітлення)
Особливості заливки в парафін великих об'єктів
Заливка в парафін дозволяє отримувати гістологічні зрізи великих розмірів (гістотопографіческіе зрізи), наприклад зрізи всього органу (матка, нирка) або його значної частини (частка легкого). Заливку проводять вручну, і для неї потрібен додатковий час на всіх етапах. Для приготування таких зрізів з тканини головного мозку за допомогою мозкового ножа де-гавкають зріз свіжої тканини товщиною близько 1 см і закладають в ванну з фіксатором. Для того щоб зберегти плоску конфі-гурацію зрізу, його кладуть між двома дротяними сітками, які притягують один до одного гумовими кільцями. Про-тривалість фіксації 48 ч. Після промивання в проточній воді (3-4 ч) слід зневоднення в 70%, 96% і 100% спір-ті (по 2 зміни) протягом 48 год. Для зневоднення можна при-нити ізопропіловий спирт , забезпечуючи часту його зміну і температуру 45 ° С (у термостаті). Це дозволяє уникнути по-лучения надмірно жорстких препаратів. Як переможе-точної середовища використовують метілбензоат або хлороформ - 3 зміни по 3 дні. Об'єкти заливають в парафін або парапласт, що мають температуру плавлення 56-58 ° С.
Приготування парафінових блоків
Просочені парафіном шматочки тканини викладають в спеці-альні формочки і заливають розплавленим в термостаті або на водяній бані при 60 ° С парафіном, в який додано 1 - 3% воску.
Для отримання парафінових блоків потрібної форми викорис-товують різні пристосування. До них відносяться виготовляють-мі самим лаборантом паперові коробочки, на дно яких викладають шматочки, а поруч до бічної стінки ставлять етикет-ку номером назовні; металеві Г-образні косинці або роз'ємні формочки, які перед вживанням змащують гліцерином і поміщають на нагріту металеву пластин-ку, що виконує роль дна формочок. Застосовують також раз-особисті пластмасові коробочки і форми, зокрема використовувані в мікробіології, особливо при заливці дрібних об'єктивним тов, таких як матеріал пункційної біопсії.
Спеціальні імпортні апарати для заливки в парафін (так звані заливальні центри) забезпечені набором раз-особистих формочок (касет) і пінцетів. У них забезпечується автоматична подача дрібних доз парафіну оптимальної температури.
Розкладання шматочків в формочки і їх орієнтування потрібно проводити швидко теплим пінцетом. Якщо матеріалу для заливки багато і він швидко остигає, то можна використовувати пара-фін, підігрітий на водяній бані до 60 ° С. Для охолодження фор-мочки з матеріалом рекомендують поміщати в воду при 10- 18 ° С, але не занурювати в неї. При застиганні парафіну поверхню блоку стягується, і в ньому утворюється кратероподібне поглиблення. Це потрібно враховувати при заливці шматочків і в подальшій роботі з блоками. Парафін повинен на 3-4 мм виступати над по-поверхнею блоку, якщо має бути монтувати його на дерев'яну колодку. Можливі також заливка блоку великою кількістю парафіну і різання без використання дерев'яних колодок, з успе-хом застосовується навіть на санному мікротому.
У більшості посібників рекомендують після підрівнювання і видалення зайвого парафіну наклеювати блоки на дере-вянние бруски за допомогою підігрітого на спиртівці металеві-чеського шпателя або скальпеля. Потім для забезпечення більш міцного приклеювання підстави блок оплавляют з чотирьох бічних сторін тим же гарячим шпателем або скальпелем.
Заливка тканини в целлоидин
Целлоидин - добре розчиняється в ефірі нітроклетчат-ка. У гістологічної практиці застосовують 2%, 4% і 8% рас-творити целлоидин, які готують з целлоідінових пластин або відмитої від емульсії і висушеної рентгенівської плівки.
Для приготування 500 мл 2% розчину целлоидин 10 г сухого целлоидин заливають 250 мл 100% спирту і залишають на 1 добу, потім додають 250 мл безводного ефіру, який розчиняє набряклий в спирті целлоидин. Для приготування 4% і 8% розчинів кількість целлоидин збільшують со-відповідально в 2 і 4 рази. Розчини зберігають в щільно закритому посуді.
Заливка тканини в целлоидин стала в даний час менш популярною, ніж парафінова, та її застосовують головним обра-зом для обробки труднорежущіхся тканин і об'єктів біль-ших розмірів, з яких важко отримати хороші парафино-ші зрізи. Целлоідіновую заливку використовують також в тих випадках, коли необхідно уникнути впливу на досліджуючи-мий матеріал високих температур. Крім того, заливка мате-ріалів в целлоидин дозволяє отримати кращі результати при наявності в об'єктах великих порожнин, лакун і верств различ-ної консистенції.
Ефір і сухий целлоидин вогненебезпечні, тому при роботі з ними необхідна обережність.
Зневоднений матеріал поміщають в суміш 100% спирту з ефіром (1: 1) на 4-6ч, переносять в 2% розчин целлоидин на 2-3 дня, потім в 4% і 8% розчини на 5-7 днів в кожен. Просочений шматочок заливають свіжим 8% целлоидин уп-лотняют в парах хлороформу (в ексикаторі). Ущільнений таким чином матеріал заливають 70% спиртом для зберігання. Вирізані блоки наклеюють густим целлоидин на дере-вянние колодки на 1 діб перед різкою.
Целлоидин 8- 10% 1 - 2 д
Хлороформ 2 - 3 д
Спирт 70% зберігання
Особливості заливки в целлоидин великих об'єктів
Целлоідіновая заливка, так само як і заливка в парафін, дозволяє отримувати гістотопографіческіе зрізи. Пластини тканини органу товщиною 1 см кладуть між двома дротяними сітками (як для заливки в парафін), фіксують, промивають і зневоднюють. Загальна тривалість процесу заливки в целлоидин великих об'єктів 2-2,5 міс. За допомогою целлоідіновой заливки можна отримати гістотопографіческіе зрізи товщиною близько 20 мкм.
Заливка в целлоидин-парафін
Цей метод рекомендується для обробки об'єктів, які легко стискуються при парафінової заливки, наприклад органів кровотворення, мезенхимной тканини, а також органів і тканин, що мають багатошарову будову (трахея, шкіра та ін.).
Використовують також суміш целлоидин з касторовою олією (1: 1), перебування в якій об'єктів протягом 1-2 днів послабшають шает їх просочування. Потім для видалення касторової олії матеріал промивають в трьох порціях хлороформу.
Схема заливки в целлоидин матеріалу для гістотопограмм по Меркулову
Заливка в целлоидин-парафін
Заливка в желатин
Для дослідження ліпідів в пухких тканинах і органах, а також .при вивченні ембріональних об'єктів з успіхом застосовують заливку в водорозчинний біополімер желатин. Використовують прозорий кристалічний харчовий желатин, з якого готують 25% і 12,5% розчини.
До 25 г желатину додають 75 мл 1% водного розчину фе-Нола (карболова вода) і поміщають в термостат при 37 ° С. Желатин набухає, і після перемішування утворюється густий 25% розчин. З нього при розведенні теплою (37 ° С) карболової водою в 2 рази отримують 12,5% розчин желатину.
Приготовлені розчини розливають в чисті сухі про-бирки для одноразового використання і закривають пробкою. У застиглому стані желатин можна довго зберігати в темному прохолодному місці.
Схема заливки в желатин по Волкової-Єлецькому
Залитий в желатин матеріал ріжуть на заморожувати мікротому. З отриманих зрізів видаляють желатин, щоб через бігти фарбування фону. Для цього зрізи поміщають на 30 хв в 10% розчин гідроксиду калію при 37 ° С. Потім їх про-мивают у водопровідній воді і фарбують. Пофарбовані зрізи укладають в полівініловий спирт або гліцерин-ба-тин.
Приготування полівінілового спирту: порошок полівінілового спирту відмивають в 96% спирті (2 зміни), ефірі (3 зміни) і висушують. До 16 г відмитого порошку додають 100 мл дистильованої води, залишають на 12 ч для набухання. Як і отриману масу нагрівають протягом 20-30 хв на киплячій по-дяной лазні. На поверхні густий мутнуватої рідини обра-зуется плівка з бульбашками, яку видаляють, а розчин фильт-ють через 4 шари марлі. Полівінілхлорид можна вико-ристовувати як проміжне середовище для отримання постійних препаратів після різання на заморожувати мікротому. Снача-ла на зріз, розправлені на склі, наносять полівініловий спирт, потім після утворення тонкої плівки (через 6-12 годин) препарат укладають в полістирол або бальзам.
Приготування гліцерин-желатину: до 7 г желатину додають 41 мл дистильованої води і залишають для набухання 3-4 ч. Потім додають 50 мл гліцерину і 1 г фенолу. Суміш нагрівають на водяній бані, постійно помішуючи. Розчин фільтрують через великопористий фільтр, розливають по про-бирками, закривають пробками і зберігають у холодильнику.
Зрізи тканини, залитої в желатин, отримані на заморажив-вающий мікротому, можна збезводнити в спиртах, просветлить в карбол-ксилолі і укласти в бальзам або полістирол.
В інших схемах рекомендують інші концентрації желатину і тривалість перебування в ньому об'єктів.
Заливка в водорозчинні пластмаси
Для цілей гистохимии, особливо для виявлення ліпідів і фер-ментів, добре себе зарекомендувала заливка тканини в синтетичні-етичні водорозчинні пластмаси - поліетиленгліколь, полівакс, метилметакрилат і ін.
Заливка в поліетиленгліколь різної молекулярної маси по Рінерхарту-Абуль-Хею